多聚甲醛固定后利用

多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。预固定问题做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的： （1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。 （2）希望标本能够较长时间存放。 （3）做胞内染色前的准备。 但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点搜基在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站[1]，贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能派孝做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在尘漏稿实验中千万要注意不要先固定后染色。图片表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大图片表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大染色后固定问题染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.意思就是用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光[2]。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。解决方案1、如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子，请尽量不要预固定，如需长期保存样本，可以考虑冻存单个核细胞。 2、如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子，可用1％多聚甲醛预固定保存，但不能长时间使用，否则对细胞FSC、SSC和荧光强度影响大。此时可考虑使用流式中文网的FlowGuard®细胞保存液[3]，FlowGuard®是国内专利性原研产品，不含多聚甲醛，能缓释出一种特殊的弱固定成份，FSC的变化较多聚甲醛轻微，对抗原强度保持更长久，样本:保存液＝6:1～10:1，21天内检测结果稳定性好。 3、如果希望在染色后保持24小时左右的荧光稳定，仍首选建议：避光、4度，我们曾经在10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式方案非正式测试时，曾经测过数例，在避光、4度保存24小时后，荧光强度几乎无变化，细胞分群良好。 如果仍不放心，可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用保存剂